Komórki roślinne w laboratorium
Hodowanie komórek roślinnych in vitro jest powszechną praktyką w dziedzinie biotechnologii roślin, hodowli tkanek roślinnych, inżynierii genetycznej i produkcji roślin transgenicznych. Możliwość kontroli warunków hodowli pozwala na badanie różnych aspektów biologii roślin oraz wykorzystywanie tkanek roślinnych w celach komercyjnych, takich jak produkcja jednorodnego materiału rozmnożeniowego czy produkcja związków organicznych.
W hodowli in vitro tkanek roślinnych wykorzystuje się zdolność fizjologicznego przeprogramowania się komórek roślinnych i odzyskania zdolności do podziałów. Taki proces nazywamy odróżnicowaniem.
Ogólny proces hodowli tkanek i komórek roślinnych in vitro
Na początek wybiera się odpowiedni materiał roślinny, z którego zostaną pozyskane tkanki do hodowli. Rośliny takie prowadzone są w szklarniowych, kontrolowanych warunkach. Część rośliny pobraną do kultur in vitro nazywamy eksplantatem. Takim eksplantatem może być dowolna tkanka rośliny macierzystej, ale najczęściej stosuje się młode rośliny i ich nadziemne części, jak fragmenty łodyg, młode liście, czy merystermy wierzchołkowe pędów.
Materiał roślinny jest zwykle poddawany procesowi sterylizacji, aby usunąć wszelkie mikroorganizmy, które mogą skazić hodowlę. Stosuje się różne metody sterylizacji, poprzez zanurzanie w roztworach dezynfekcyjnych, jak roztwory podchlorynu sodu czy wapnia, antybiotyki i inne.
Umieszczony na pożywce eksplantat pobudza się do wytworzenia kalusa (tkanki przyrannej), który ma duże zdolności do różnicowania i wytwarzania nowych pędów. Dalsze postępowanie jest uzależnione od tego, czy nowe rośliny chcemy uzyskać drogą tzw. organogenezy czy embriogenezy. W pierwszym przypadku pobudza się kalus do wytwarzania najpierw pędów, które w kolejnym etapie pobudzane są do wytworzenia korzeni. Tak uzyskujemy całą nową roślinę. W przypadku embriogenezy następuje wytworzenie całych zarodków z pojedynczych komórek mezofilu liści lub kalusa. Pojedyncze komórki otrzymuje się poprzez mechaniczne rozbicie tkanek lub zastosowanie enzymów trawiących ściany komórkowe. Inicjowanie poszczególnych etapów rozwoju następuje poprzez dobór składu pożywki, na której umieszcza się eksplantat i kolejnych etapach rozwoju, a proces przenoszenia z pożywki na pożywkę nazywamy pasażowaniem.
Warunki kultur in vitro
Izolowane tkanki czy komórki są umieszczane w pojemnikach lub naczyniach, które zawierają odpowiednio dobraną do gatunku i etapu rozwoju pożywkę. Pożywka dostarcza składniki odżywcze niezbędne do wzrostu komórek roślinnych. Pożywka powinna zawierać wszystkie składniki, które są potrzebne do życia i prawidłowego rozwoju roślin, a więc: sole nieorganiczne (dostarczające niezbędnych makroelementów, takich jak azot, fosfor, potas, wapń, magnez i siarka; mikroelementów, czyli: żelaza, manganu, molibdenu, miedzi, jodu, cynku, boru i chloru oraz pierwiastków śladowych: kobaltu, sodu, glinu czy krzemu), węglowodany stanowiące źródło węgla (najczęściej sacharoza i glukoza), witaminy (przede wszystkim z grupy B) i regulatory wzrostu pobudzające rozwój poszczególnych organów (auksyny, cytokininy, gibereliny, kwas abscysynowy i inne). Niektóre pożywki wzbogaca się również w aminokwasy, kwasy organiczne, przeciwulteniacze, a niekiedy w antybiotyki. Składniki te rozpuszcza się w wodzie, więc tak przygotowana pożywka ma formę płynną. W celu jej zestalenia, stosuje się wytwarzany z krasnorostów agar, wyższej czystości agarozę lub polimery wytwarzane przez bakterie, jak Phytagel lub Gerlite. Pożywka, podobnie jak eksplantat, wymaga odkażenia, a wszystkie manipulacje związane z pasażowaniem przeprowadza się w sterylnych warunkach w komorach laminarnych. Kolejne etapy rozwoju przebiegają w zamkniętych pojemnikach w sterylnych warunkach.
Prowadzenie roślinnych kultur in vitro wymaga odpowiednich warunków, a zwłaszcza dobranej do gatunku i etapu rozwoju - temperatury, oświetlenia i wilgotności. Gdy sadzonki osiągną odpowiednią wielkość, zostają delikatnie przeniesione do gleby. W kontrolowanych warunkach zachodzi proces ich hartowania, czyli przyzwyczajenia roślin do warunków panujących w tunelach oraz szklarniach.